Cómo hacer un análisis espectrofotométrico: 13 pasos (con imágenes)

La espectrofotometría es una técnica experimental que se utiliza para medir la concentración de solutos en una solución específica al calcular la cantidad de luz absorbida por esos solutos. Esta técnica es poderosa porque ciertos compuestos absorberán diferentes longitudes de onda de la luz a diferentes intensidades. Al analizar la luz que pasa a través de la solución, puede identificar sustancias disueltas particulares en solución y cómo concentradas esas sustancias son. Un espectrofotómetro es el dispositivo utilizado para analizar soluciones en un entorno de investigación de laboratorio.

Pasos

Parte 1 de 3:

Preparando las muestras

1. Enciende el espectrofotómetro. La mayoría de los espectrofotómetros deben calentarse antes de que puedan dar una lectura precisa. Encienda la máquina y deje que se siente durante al menos 15 minutos antes de ejecutar las muestras.

Usa el tiempo de calentamiento para preparar tus muestras.

Imagen titulada Hacer análisis espectrofotométrico Paso 2

2. Limpie las cubetas o los tubos de ensayo. Si está haciendo un laboratorio para la escuela, puede estar usando tubos de ensayo desechables que no necesitan ser limpiados. Si está utilizando cubetas o tubos de ensayo reutilizables, asegúrese de que se limpien correctamente antes de usar. Enjuague bien cada cubeta con agua desionizada.

Tenga cuidado con las cubetas, ya que pueden ser bastante caras, especialmente si están hechas de vidrio o cuarzo. Las cubetas de cuarzo están diseñadas para su uso en espectrofotometría UV-visible.

Al manipular la cubeta, evite tocar los lados, la luz pasará a través (generalmente, los lados claros del contenedor). Si toca accidentalmente estos lados, limpie la cubeta hacia abajo con un kimwipe (que se formulan para evitar que se rasquen el vidrio).

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3. Cargue el volumen adecuado de la muestra en la cubeta. Algunas cubetas tienen un volumen máximo de 1 mililitro (ml), mientras que los tubos de ensayo pueden tener un volumen máximo de 5 ml. Mientras el láser que produzca la luz esté pasando por el líquido y no una parte vacía del contenedor, obtendrá una lectura precisa.

Si está utilizando una pipeta para cargar sus muestras, use una nueva consejo para cada muestra para evitar la contaminación cruzada.

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4. Preparar una solución de control. Conocido como un espacio en blanco, la solución de control solo tiene el solvente químico en el que se disuelve el soluto a analizar en. Por ejemplo, si tuviste sal disuelto en agua, tu espacio en blanco sería solo agua. Si teñiste el agua roja, el espacio en blanco también debe contener agua roja. El espacio en blanco es el mismo volumen que la solución que se va a analizar y mantener en el mismo tipo de contenedor.

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5. Limpie el exterior de la cubeta. Antes de colocar la cubeta en el espectrofotómetro, desea asegurarse de que sea lo más limpio posible para evitar la interferencia de las partículas de suciedad o polvo. Usando un paño sin pelusas, retire las gotas de agua o el polvo que pueda estar en el exterior de la cubeta.

Parte 2 de 3:

Ejecutando el experimento

1. Elija y configure la longitud de onda de la luz para analizar la muestra con. Use una sola longitud de onda de luz (color monocromático) para hacer que las pruebas sean más efectivas. El color de la luz elegido debe ser uno conocido por ser absorbido por uno de los químicos que se cree que están en el soluto de prueba. Establezca la longitud de onda deseada de acuerdo con las especificaciones de su espectrofotómetro.

En un laboratorio de aula, la longitud de onda probablemente se le dará a usted.
Debido a que la muestra reflejará toda la luz del mismo color que aparece, la longitud de onda experimental siempre será un color diferente a la de la muestra.

Los objetos aparecen como ciertos colores porque reflejan la luz de las longitudes de onda particulares y absorben todos los demás colores. La hierba es verde porque la clorofila en él refleja la luz verde y absorbe todo lo demás.

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2. Calibrar la máquina con el espacio en blanco. Coloque el espacio en blanco en el soporte de la cubeta y cierre la tapa. En un espectrofotómetro analógico, habrá una pantalla con una aguja que se mueva en función de la intensidad de la detección de luz. Cuando el espacio en blanco se encuentra, deberías ver la aguja moverse a la derecha. Registre este valor en caso de que lo necesite para más tarde. Con el espacio en blanco todavía en la máquina, mueva la aguja a cero usando la perilla de ajuste.

Los espectrofotómetros digitales se pueden calibrar de la misma manera, solo tendrán una lectura digital. Ponga el espacio en blanco a 0 usando las perillas de ajuste.

Cuando quita el espacio en blanco, la calibración aún estará en su lugar. Al medir el resto de sus muestras, la absorbancia del espacio en blanco se restará automáticamente.

Asegúrese de usar un solo espacio en blanco por sesión para que cada muestra esté calibrada al mismo espacio en blanco. Por ejemplo, si está en blanco del espectrofotómetro, luego analice solo algunas de las muestras y vuelva a estar en blanco, las muestras restantes serían inexactas. Tendrías que empezar sobre.

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3. Retire el espacio en blanco y pruebe la calibración. Con el espacio en blanco, la aguja debe permanecer en 0 (cero) o la lectura digital debe continuar leyendo 0. Coloque el espacio en blanco en la máquina y asegúrese de que la aguja o la lectura no cambie. Si la máquina está correctamente calibrada con su espacio en blanco, todo debe permanecer en 0.

Si la aguja o la lectura no es 0, repita los pasos de calibración con el espacio en blanco.

Si continúa teniendo problemas, busque ayuda o haga que la máquina haya buscado mantenimiento.

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4. Mida la absorbancia de su muestra experimental. Retire el espacio en blanco y coloque la muestra experimental en la máquina. Deslice la cubeta en la ranura designada y asegúrese de que se quede en posición vertical. Espere unos 10 segundos hasta que la aguja esté estable o hasta que los números digitales dejen de cambiar. Registre los valores de% de transmitancia y / o absorbancia.

La absorbancia también se conoce como la densidad óptica (OD).

Cuanta más luz que se transmita, menos luz, la muestra absorbe. En general, desea registrar los valores de absorbancia que generalmente se darán como un decimal, por ejemplo, 0.43.

Si obtienes un resultado periférico (como 0.900 cuando el resto están alrededor de 0.400), diluyen la muestra y miden la absorbancia de nuevo.

Repita la lectura para cada muestra individual al menos 3 veces y promediarlos juntos. Esto asegura una lectura más precisa.

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5. Repita la prueba con sucesivas longitudes de onda de luz. Su muestra puede tener múltiples compuestos desconocidos que variarán en su absorbancia dependiendo de la longitud de onda. Para eliminar la incertidumbre, repita sus lecturas a intervalos de 25 nm a través del espectro. Esto le permitirá detectar otros productos químicos sospechosos de estar en el soluto.

Parte 3 de 3:

Analizando los datos de absorbancia

1. Calcula la transmitancia y la absorbancia de la muestra. La transmitancia es la cantidad de luz que pasó a través de la muestra alcanzó el espectrofotómetro. La absorbancia es la cantidad de luz que ha sido absorbida por uno de los productos químicos en el soluto. Muchos espectrofotómetros modernos tienen una producción de transmitancia y absorbancia, pero si registra la intensidad, puede calcular estos valores.

La transmitancia (T) se encuentra dividiendo la intensidad de la luz que pasó a través de la solución de muestra con la cantidad que pasó a través del espacio en blanco. Normalmente se expresa como un decimal o porcentaje. T = i / i₀ donde yo soy la intensidad de la muestra y yo₀ es la intensidad del espacio en blanco.
La absorbancia (a) se expresa como negativa del logaritmo base-10 (exponente) del valor de transmitancia: a = -log₁₀T. Por un valor t de 0.1, el valor de A es 1 (0.1 es 10 a la potencia -1), lo que significa que se transmite el 10% de la luz y el 90% se absorbe. Por un valor t de 0.01, el valor de A es 2 (0.01 es 10 a la potencia -2), lo que significa que el 1% de la luz se transmite.

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2. Parcela los valores de absorbancia frente a las longitudes de onda en un gráfico. El valor de absorbancia se traza en el eje Y vertical contra la longitud de onda de la luz utilizada para una prueba dada trazada en el eje X horizontal. Trazando los valores de absorbancia máxima para cada longitud de onda de la luz probada, produce el espectro de absorbancia de la muestra e identifica los compuestos que forman la sustancia de prueba y sus proporciones.

Un espectro de absorbancia generalmente tiene picos en ciertas longitudes de onda que pueden permitirle identificar compuestos específicos.

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3. Compara su complot de espectro de absorbancia a las parcelas conocidas de compuestos específicos. Los compuestos tienen un espectro de absorbancia único y siempre producirán un pico en la misma longitud de onda cada vez que se miden. Al comparar sus parcelas de compuestos desconocidos a los de los compuestos conocidos, puede identificar los solutos que componen su solución.

También puede usar este método para identificar contaminantes en su muestra. Si está esperando 1 pico transparente en una longitud de onda específica y obtiene 2 picos en longitudes de onda separadas, sabe que algo no está en su muestra.

Cosas que necesitarás

Espectrofotómetro
Sustancia en solución a analizar
Solvente adicional (para solución en blanco)
Contenedores para pruebas y soluciones en blanco (cubetas, tubos de ensayo, etc.)